TUBERIN-Phosphorylation site prediction

目前已知AKT蛋白質會藉磷酸化作用 (phosphorylation) 調控HAMARTIN/
TUBERIN蛋白質複合體 (protein complex) 的活性。在此以Group-based Prediction System (GPS 2.1) 分析TUBERIN的胺基酸序列中，可能被AKT磷酸化的位置。結果顯示TUBERIN的Ser939、Ser1130與Thr1462很可能會受AKT磷酸化。其中Ser939與Thr1462已被證實會受AKT磷酸化，且TUBERIN的活性將因此而被抑制。

HAMARTIN-Phosphorylation site prediction

目前已知AKT蛋白質會藉磷酸化作用 (phosphorylation) 調控HAMARTIN/

TUBERIN蛋白質複合體 (protein complex) 的活性。在此以Group-based Prediction System (GPS 2.1) 分析HAMARTIN的胺基酸序列中，可能被AKT磷酸化的位置。結果顯示HAMARTIN蛋白質無明顯會被AKT磷酸化的可能位置，由此可推測AKT主要調控的對象可能是TUBERIN蛋白質。

TUBERIN-Pattern and profile search

藉由MotifScan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)分析TUBERIN的胺基酸序列，推測TUBERIN可能含有三種profile。由N端 (N-terminus) 至C端 (C-terminus) 分別為Phosphatase tensin-type domain profile、HEAT repeat profile與Rap GTPase activating proteins domain profile。其中前兩者位於接近N端的區域，後者則位於接近C端的區域。藉由GTPase activating domain，TUBERIN可活化下游蛋白質─Rheb─的GTPase活性，使其將攜帶的GTP分解成GDP，成為非活化態 (inactive)。

HAMARTIN-Pattern and profile search

藉由MotifScan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)分析HAMARTIN的胺基酸序列，推測HAMARTIN可能含有四種profile。由N端 (N-terminus) 至C端 (C-terminus) 分別為Bipartite nuclear localization signal profile、Glutamine-rich region profile、Nebulin repeat profile與Serine-rich region profile。四種profile皆分佈於蛋白質中央至C端的區域。

TUBERIN-Leucine zipper prediction

利用2ZIP (http://2zip.molgen.mpg.de/index.html) 分析TUBERIN的胺基酸序列，搭配COILS (http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html) 的分析結果，推測TUBERIN接近N端 (N-terminus) 的區域可能具有包含白胺酸 (leucine) 的α螺旋 (α-helix)，但不足以形成白胺酸拉鏈 (leucine zipper) 的模式 (motif)。推測此結構乃是用於與HAMARTIN上包含白胺酸的α螺旋結合，形成白胺酸拉鏈的模式，藉此使HAMARTIN與TUBERIN形成蛋白質複合體 (protein complex)。

HAMARTIN-Leucine zipper prediction

利用2ZIP (http://2zip.molgen.mpg.de/index.html) 分析HAMARTIN的胺基酸序列，搭配COILS (http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html) 的分析結果，推測HAMARTIN接近C端 (C-terminus) 的區域可能具有包含白胺酸 (leucine) 的α螺旋 (α-helix)，但不足以形成白胺酸拉鏈 (leucine zipper) 的模式 (motif)。推測此結構乃是用於與TUBERIN上包含白胺酸的α螺旋結合，形成白胺酸拉鏈的模式，藉此使HAMARTIN與TUBERIN形成蛋白質複合體 (protein complex)。

TUBERIN-Coiled coil prediction

以COILS (http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html) 分析TUBERIN的胺基酸序列，推測接近N端 (N-terminus) 與中央的區域有α螺旋 (α-helix) 的二級結構，且可能組成coiled-coil的模式。推測可能用於與HAMARTIN結合，形成蛋白質複合體 (protein complex)。

HAMARTIN-Coiled coil prediction

以COILS (http://www.ch.embnet.org/software/COILS_form.html) 分析HAMARTIN的胺基酸序列，推測接近C端 (C-terminus) 的區域有大量α螺旋 (α-helix) 的二級結構，且可能組成coiled-coil的模式。推測可能用於與TUBERIN結合，形成蛋白質複合體 (protein complex)。

TUBERIN-Topology prediction

根據PSORT II Prediction (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form2.html) 分析TUBERIN胺基酸序列的結果，推測TUBERIN有34.8%的可能性會存在於細胞膜，有17.4%的可能性會存在於內質網。搜尋ExPASy (http://tw.expasy.org/) 網路資料庫，得知TUBERIN乃是細胞膜的膜蛋白 (membrane protein)，且屬於peripheral membrane protein。在此程式計算的結果符合實際的情況。

HAMARTIN-Topology prediction

根據PSORT II Prediction (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form2.html) 分析HAMARTIN胺基酸序列的結果，推測HAMARTIN有65.2%的可能性會存在於細胞核，有13.0%的可能性會存在於細胞膜。但搜尋ExPASy (http://tw.expasy.org/) 網路資料庫，得知HAMARTIN乃是細胞膜的膜蛋白 (membrane protein)，且屬於peripheral membrane protein。由此可見程式計算的結果仍與現實有所差異。

TUBERIN-Protein sequence characterization

利用ProtParam (http://tw.expasy.org/tools/protparam.html) 分析TUBERIN的胺基酸序列。結果顯示：1. TUBERIN由1807個胺基酸組成。2. TUBERIN的分子量約為201 kDa (kilodalton)。3. TUBERIN的等電點 (pI) 約為pH 7.0。4. TUBERIN的半衰期 (half-life) 約為30分鐘。

HAMARTIN-Protein sequence characterization

利用ProtParam (http://tw.expasy.org/tools/protparam.html) 分析HAMARTIN的胺基酸序列。結果顯示：1. HAMARTIN由1164個胺基酸組成。2. HAMARTIN的分子量約為130 kDa (kilodalton)。3. HAMARTIN的等電點 (pI) 約為pH 6.0。4. HAMARTIN的半衰期 (half-life) 約為30分鐘。

Insulin/IGF pathway-protein kinase B signaling cascade

當細胞接受胰島素 (insulin) 或類胰島素生長因子 (insulin-like growth factor；IGF)，AKT將抑制TSC1/2複合體 (complex) 的活性，使細胞增生不受抑制。

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雖然AMPK與AKT皆可將TSC1/2複合體磷酸化，但根據作用的位置不同，可活化或抑制TSC1/2複合體的活性。
圖片來源: http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/

p53 pathway by glucose deprivation

當細胞缺乏葡萄糖 (glucose) ，AMPK將活化TSC1/2複合體 (complex)。活化態的TSC1/2複合體將抑制下游蛋白質─Rheb─的活性，進而抑制mTOR (mammalian target of rapamycin) pathway，阻止細胞增生。同時AMPK亦會活化S15p53，啟動p53 pathway，抑制細胞增生。

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雖然AMPK與AKT皆可將TSC1/2複合體磷酸化，但根據作用的位置不同，可活化或抑制TSC1/2複合體的活性。

圖片來源: http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/

TUBERIN-Family information

TUBERIN乃是TSC2基因經轉譯作用 (translation) 產生的蛋白質。搜尋InterP-

roScan Sequence Search (http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/)，得知TUBERIN在細胞中扮演G蛋白調節者 (G-protein modulator) 的角色。G蛋白調節者可分為兩類：Guanyl-nucleotide exchange factor (GEF)與Other G-protein modulator。TUBERIN即屬於Other G-protein modulator。同時亦得知TUBERIN除調控細胞週期 (cell cycle)，亦調控胞吞作用 (endocytosis)。TUBERIN在細胞中參與兩條訊息傳遞路徑：1. p53 pathway by glucose deprivation。2. Insulin/IGF pathway-protein kinase B signaling cascade。

HAMARTIN-Family information

HAMARTIN為TSC1基因經轉譯作用 (translation) 產生的蛋白質。搜尋Inter-

ProScan Sequence Search (http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/)

資料庫，得知hamartin在細胞中參與調控的兩條訊息傳遞路徑：1. p53 path-

way by glucose deprivation。2. Insulin/IGF pathway-protein kinase B sign-

aling cascade。

TSC2-Phylogenetic analysis

經胺基酸序列比對後，再以CLC sequence viewer 5製作Neighbor Joining (NJ) 演化樹。結果顯示除栗酒裂殖酵母菌 (Schizosaccharomyces pombe) 外，其餘物種的TSC2蛋白質相似度皆高。

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Homo sapiens：智人 (人類)。Pan troglodytes：黑猩猩。Macaca mulatta：普通獼猴。Equus caballus：蒙古野馬。Rattus norvegicus：溝鼠 (大鼠)。Mus musculus：家鼷鼠 (小鼠)。Schizosaccharomyces pombe：栗酒裂殖酵母菌。

TSC2-Orthologous proteins alignment

目前TSC2基因家族 (gene family) 中已知的基因亦只有一個─TSC2，但於其他物種已找到TSC2基因的同源基因 (ortholog)。藉由CLC sequence viewer 5比對胺基酸序列，得知各物種間TSC2 (TUBERIN) 蛋白質的相似度。結果顯示TSC2蛋白質在演化上具有高保留性 (highly conserved)。
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Homo sapiens：智人 (人類)。Pan troglodytes：黑猩猩。Macaca mulatta：普通獼猴。Equus caballus：蒙古野馬。Rattus norvegicus：溝鼠 (大鼠)。Mus musculus：家鼷鼠 (小鼠)。Schizosaccharomyces pombe：栗酒裂殖酵母菌。

TSC1-Phylogenetic analysis

經胺基酸序列比對後，再以CLC sequence viewer 5製作Neighbor Joining (NJ) 演化樹。結果顯示TSC1蛋白質在物種間可分成兩大群，分別為與人類 (Homo sapiens) 相似的一群及與黑猩猩 (Pan troglodytes) 相似的一群。多數哺乳動物 (mammalian) 屬於與黑猩猩相似的一群。
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Homo sapiens：智人 (人類)。Pan troglodytes：黑猩猩。Macaca mulatta：普通獼猴。Canis familiaris：狗。Equus caballus：蒙古野馬。Bos taurus：牛。Gallus gallus：雞。Rattus norvegicus：溝鼠 (大鼠)。Mus musculus：家鼷鼠 (小鼠)。Drosophila melanogaster：果蠅。Schizosaccharomyces pombe：栗酒裂殖酵母菌。

TSC1-Orthologous proteins alignment

目前TSC1基因家族 (gene family) 中已知的基因只有一個─TSC1，但已於其他物種找到TSC1基因的同源基因 (ortholog)。藉由CLC sequence viewer 5的胺基酸序列比對，得知各物種間TSC1 (HAMARTIN) 蛋白質的相似度。結果顯示TSC1蛋白質於演化上具有高保留性 (highly conserved)。

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Homo sapiens：智人 (人類)。Pan troglodytes：黑猩猩。Macaca mulatta：普通獼猴。Canis familiaris：狗。Equus caballus：蒙古野馬。Bos taurus：牛。Gallus gallus：雞。Rattus norvegicus：溝鼠 (大鼠)。Mus musculus：家鼷鼠 (小鼠)。Drosophila melanogaster：果蠅。Schizosaccharomyces pombe：栗酒裂殖酵母菌。

TSC1 & TSC2 proteins alignment

TSC1基因與TSC2基因雖名稱相似，但生成的蛋白質─HAMARTIN與TUBE-

RIN─卻有顯著的差異，因此TSC1基因與TSC2基因不可被歸類為同一基因家族 (gene family)。上圖為CLC sequence viewer 5胺基酸序列比對的結果，TSC1 (HAMARTIN) 與TSC2 (TUBERIN) 的胺基酸序列有明顯的差異。

TSC2 gene (MIM 191092)

搜尋NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 網路資料庫，得知TSC2 (tuberous sclerosis complex-2) 基因位於第16對染色體短臂13.3區 (chromosome 16p13.3；圖A)。cDNA全長為5675 bp (base pairs)，共有41個外顯子 (exon) 與一個領導外顯子 (leading exon)。編碼區 (coding region) 總長為5424 bp，散佈於41個外顯子 (圖B)。圖C為TSC2基因與周圍基因的相對位置及方向性。TSC2基因轉譯 (translate) 的蛋白質名為TUBERIN，會與TSC1基因轉譯的蛋白質－HAMARTIN－形成複合體。

TSC1 gene (MIM 605284)

搜尋NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 網路資料庫，得知TSC1 (tuberous sclerosis complex-1) 基因位於第9對染色體長臂34區 (chromosome 9q34；圖A)。cDNA全長為8617 bp (base pairs)，共有23個外顯子 (exon)。編碼區 (coding region) 總長為3495 bp，分散於21個外顯子 (圖B)。圖C為TSC1基因與周圍基因的相對位置與方向性。TSC1基因轉譯 (translate) 的蛋白質稱為HAMARTIN，會與TSC2基因轉譯的蛋白質－TUBERIN－形成復合體。

Molecular mechanism of tuberous sclerosis

結節硬化症主要由TSC1 (tuberous sclerosis complex-1) 與TSC2 (tuberous sclerosis complex-2) 兩個抑癌基因 (tumor suppressor gene) 的突變所造成。兩基因生成的蛋白質會結合形成復合體，進而影響下游蛋白質的活性。如圖所示，TSC1基因與TSC2基因的蛋白質複合體會調控mTOR (mammalian target of rapamycin) 訊息傳遞路徑，進而調控細胞增生。若TSC1或TSC2功能喪失，細胞增生將不受控制。

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圖片來源: http://www.biocarta.com/pathfiles/h_mtorPathway.asp

Introduction of tuberous sclerosis (MIM 191100)

結節硬化症 (tuberous sclerosis；TS) 是一種體染色體顯性 (autosomal
dominant)遺傳疾病。其發生率為1/6000至1/10000，外顯率 (penetrance)
則為100 %。結節硬化症的病理特徵為身體多個器官會有缺陷瘤 (hamartoma)
─多種發育成熟的細胞因異常分裂與分佈而形成良性腫瘤─的形成，包括腦、
皮膚、腎臟、心臟、肺臟與其他器官。此外，患者亦有智能障礙 (mental
retardation)、癲癇 (epileptic seizure) 與其他行為障礙。

圖片來源:
1. http://www.netterimages.compublication978192900745513-450.htm/
2. http://www.uwo.cacnsresidentpiclib.html/